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天津本生—PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。
2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA的片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA的片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;
?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材
模板DNA、2.5mmol/LdNTP
TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物
10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O
PCR儀、移液槍、PCR板
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：
模板DNA2μL
引物11μL
引物21μL
dNTP1.5μL
MgCl22μL
10×buffer2μL
ddH2O10μL
Taq酶0.5μL
2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。
3、上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序。
4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。
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